几种常见的染色方法

2017-05-25  来自: 西安天和实验室设备有限公司 浏览次数:277

几种常见的染色方法



(一)亮发光杆菌单染色法  

    只应用一种染料进行染色的方法,如美蓝染色法。

    美蓝染色法:在已干燥、固定好的抹片上,滴加适量的(足够覆盖抹片点即可)美蓝染色液,经1~2分钟,水洗,沥去多余的水分,吸干或烘干(不能太热),然后镜检。

(二)复染色法  

    应用两种或两种以上的染料或再加助染剂进行染色的方法。染色时,有些是将染料分别先后使用,有些则同时混合使用,染色后不同的细菌和物体或者细菌结构的不同部分,可以呈现不同颜色,有鉴别细菌的作用,又可称为鉴别染色,如革兰氏染色法,抗酸染色法,瑞特氏染色法和姬姆萨氏染色法等。

1.革兰氏染色法

(1)在已干燥,固定好的抹片上,滴加草酸铵结晶紫染色液,经1~2分钟,水洗。

(2)加革兰氏碘液于抹片上媒染,1~3分钟,水洗。

(3)加95%酒精于抹片上脱色,约30秒至1分钟,水洗。

(4)加10倍稀释复红液复染1~2分钟,水洗。

(5)吸干或烘干,镜检。革兰氏阳性细菌呈蓝紫色,革兰氏阴性细菌呈红色。

2.抗酸染色法

(1)在已干燥,固定好的抹片上滴加较多量的复红染色液,将玻片置酒精灯火焰上缓缓加热,至产生蒸汽即止(不要煮沸),维持微微产生蒸汽,经3~5分钟,水洗。

(2)用3%盐酸酒精脱色,直至标本无颜色脱出为止,充分水洗。

(3)用美蓝染色液复染约1分钟,水洗。

(4)吸干或烘干,镜检。抗酸性细菌呈红色,非抗酸性细菌呈蓝色。

3.瑞特氏染色法

抹片自然干燥后,滴加瑞氏染色液于其上,为了避免很快变干,染色液可稍多加些,或者看情况补充滴加,经1~3分钟,加约与染液等量的中性蒸馏水或磷酸盐缓冲液,轻轻晃动玻片,使与染液混匀,经3分钟左右,直接用水冲洗(不可先将染液倾去),吸干或烘干,镜检。细菌染成蓝色,组织、细胞等呈其他颜色。

4.姬姆萨氏染色法

(1)于5ml新煮过的中性蒸馏水中滴加5~10滴姬姆萨氏染色液原液,即稀释成为常用的姬姆萨氏染色液。

(2)抹片经甲醇固定并干燥后,在其上滴加足量的染色液或将抹片浸入盛有染色液的染色缸中,染色30分钟,或染色数小时至24小时,取出水洗,吸干或烘干,镜检。细菌呈蓝青色,组织、细胞等呈其他颜色。视野常呈淡红色。

5.荚膜染色法

(1)涂片、干燥  同单染色法。

(2)固定  滴加甲醇液于涂抹面上,固定2~3分钟。

(3)水洗  倾去甲醇液,用水轻冲洗。

(4)染色  滴加碱性美兰染色液数滴于涂抹面上,染色2~3分钟。

(5)水洗  倾去染色液,用水轻冲洗。

(6)干燥,镜检  菌体染成蓝色,荚膜染成粉红色或无色。

    荚膜染色的原理:荚膜染色主要用于炭疽杆菌病料的荚膜检查。因为炭疽杆菌荚膜系由d-谷氨酸组成的多肽所构成,而菌体的主要成分则为核蛋白,因二者着色力不同,染色水洗后,则可把荚膜上一部分染料冲洗掉,颜色变淡,故显微镜检查时,在着色较深的菌体周围看到一圈呈淡紫色的膜,即荚膜。又因碱性美兰是一种多染性染料,故菌体染为蓝色,荚膜则染成淡蔷薇色。

6.亮发光杆菌芽胞染色法

(1)将有芽胞的材料作涂片、干燥、固定。

(2)将5%孔雀绿水溶液滴加于固定好的涂片上。

(3)用木夹夹住载玻片在酒精灯火焰上加热,使染料冒蒸汽(但不能煮沸),切勿使染料蒸干,必要时可添加少许染料。加热时间从冒蒸汽时开始计算约4~5分钟。

(4)倾去染色液,待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再退色为止。

(5)用0.5%沙黄水溶液复染1分钟,水洗。

(6)干燥或烘干后,置油镜观察,芽胞呈绿色,菌体呈红色。

7.鞭毛染色法之一

(1)涂片  取10~12小时的幼龄培养菌,用1%福尔马林水溶液制成菌液,在37℃温箱中固定24小时,涂抹于载玻片上。

(2)自然干燥,不固定。

(3)用下述染色液加温染色30秒到1分钟,然后静置1~2分钟。

(4)染色液配制

①0.5%水溶液(加温溶解后过滤)1.0ml。

②20%鞣酸水溶液(加温溶解,不过滤)1.0ml。

③5%钾明矾水溶液(加温溶解后过滤)0.5ml。

④10%复红酒精溶液(配制后7天过滤)0.5ml。

上述染色液在用前,按①、②、③、④的顺序混合后,即可使用(染色液现配现用)。

(4)水洗、干燥、镜检。

(5)结果  菌体呈深红色,鞭毛呈淡红色。

8.鞭毛染色之二

(1)脱脂玻片的准备  要用新的或表面没有磨损痕迹的玻片。先用洗衣粉煮10~15分钟,取出玻片用清水洗净,再放入洗涤液中浸泡24小时左右,取出后,用自来水和蒸馏水洗净,再用95%酒精脱脂,用火焰烧去酒精,即可使用。如不立即使用,可在脱脂后放于干净的盒中,或浸泡于95%酒精中,用前在火焰上烧去酒精,冷却后使用。

(2)菌种  应用有冷凝水的新制琼脂斜面接种,培养10~12小时应用。如所用菌种久未移植,在这种斜面上每天移植一次,连续移植2~3次后使用。

(3)染色液的配制

甲液: 

单宁酸            5g

FeCl3             1.5g

蒸馏水            100ml

15%福尔马林      2.0ml

1%NaOH          1.0ml

配好后,当天使用,次日效果差,第3天则不好用。

乙液: 

AgNO3      2g

蒸馏水      100ml

   待AgNO3溶解后,取出10ml备用,再向余下的90mlAgNO3中滴入浓氨水,使之成为很浓的氢氢化银,再继续滴加氨水变为透明,直到重新形成的沉淀物又刚刚溶解为止。再将备用的10ml AgNO3慢慢滴入,则出现薄雾,但轻轻摇动后,薄雾状沉淀又消失,再滴入AgN03,直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。如所呈薄雾不重,即可使用,此染剂可使用一周。如雾过重、则银盐被沉淀出,不宜使用。

(4)染色方法  在载玻片一端加蒸馏水一滴,再用接种环钓取少量细菌于水滴中沾几下,将载玻片倾斜,使水滴流到另一端,然后将载玻片稍斜或平放,在空气中干燥后,在涂片上滴加甲液染色2~4分钟,用蒸馏水冲洗,将残水甩干,或用乙液冲去水后,再加乙液染色30~60秒钟,然后用蒸馏水冲洗,在空气中晾干,镜检。如未见鞭毛,应在整个涂片上多找几个视野,有时只在部分涂片上染出鞭毛来。如加乙液后,将载玻片在酒精灯上稍加热,使其微冒蒸汽且不干,则效果更好。

9.立克次氏体染色法

(1)涂片  以病料制成涂片。

(2)干燥、微加温固定。

(3)染色  滴加0.25%碱性复红水溶液(染色液调至pH7.2~7.4),用滤纸过滤,染色4分钟。

(4)脱色  用0.5%枸橼酸把多余的染色液洗脱掉。

(5)水洗

(6)复染  1%美兰水溶液复染数秒钟。

(7)水洗、干燥、镜检。

(8)亮发光杆菌结果  立克次氏体呈红色,其他组织细胞呈蓝色。


关键词: 染色方法           

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